Пара герметичных пластиковых пробирок с реагентами, пробирки с контрольными образцами плюс инструкция: тест-системы для определения вирусной инфекции — предметы совсем не зрелищные и не фотогеничные. Тем не менее в разгар пандемии именно от них зависит быстрая диагностика новой болезни, а часто и сама жизнь.

Пара герметичных пластиковых пробирок с реагентами, пробирки с контрольными образцами плюс инструкция: тест-системы для определения вирусной инфекции — предметы совсем не зрелищные и не фотогеничные. Тем не менее в разгар пандемии именно от них зависит быстрая диагностика новой болезни, а часто и сама жизнь.

Высокая температура, сухой кашель, одышка и ломота — за последние месяцы мы накрепко вызубрили основные симптомы, которыми сопровождается COVID-19. Но все это признаки не очень надежные: точно так же может проявляться и грипп, и масса других заболеваний. С бактериальной или грибковой инфекциями по‑своему проще. Их возбудителей можно выращивать в медицинских лабораториях и через несколько дней после посева увидеть колонии, а под микроскопом — отдельные клетки. «Посев до сих пор остается стандартом для диагностики многих инфекций», — говорит Максим Филипенко, главный научный сотрудник Лаборатории фармакогеномики Института химической биологии и фундаментальной медицины (ИХБФМ) СО РАН. Однако ж вирусы — бесклеточные агенты, и их невозможно культивировать так же легко и просто, без подходящих хозяев. Рассмотреть их способен разве что электронный микроскоп, да и эта картина для диагностики не всегда полезна. Внешне тот же грипп почти не отличается от коронавирусов, не приходясь им даже и близким родственником, и уж тем более не получится различить «по фотографии» тот или иной коронавирус или его штамм.

Но там, где «фоторобот» не поможет, в дело вступает анализ ДНК, золотой стандарт современной идентификации. «Этот подход особенно хорош тем, что он полностью унифицирован и работает одинаково в диагностике самых разных заболеваний, — добавляет Максим Филипенко. — Требуется одно и то же оборудование, похожие реагенты, что сильно упрощает разработку и производство новых тест-систем».


Основная реакция

И криминалисты, и вирусологи применяют одинаковый метод, разработанный в 1980-х американским биохимиком Кэри Муллисом, работы которого довольно быстро — уже в 1993-м — были отмечены Нобелевской премией. Изобретенная им полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет многократно увеличивать содержание нужных фрагментов ДНК в образце. Для этого используется извлеченный из бактерий фермент полимераза — молекулярная машина для быстрого копирования цепочек ДНК.

Диагностика COVID-19


Как часть диагностики COVID-19 иногда используется рентгенологическое обследование, которое может указать на присутствие в легких инфильтрата и развитие пневмонии.

ДНК-полимеразе требуется лишь указать место для начала работы, и для этого в раствор добавляют праймеры — короткие фрагменты искусственно синтезированной ДНК, которые связываются с соответствующими участками в образце. Закончив работу, фермент отсоединится и будет готов к следующему циклу реакции. Ее ход определяет амплификатор — прибор, который контролирует ПЦР, точно регулируя температуру. Небольшое нагревание заставляет двойные цепочки ДНК разойтись, а охлаждение дает возможность праймерам связаться со своими участками и запустить работу полимеразы. Многократная смена таких режимов позволяет снова и снова повторять синтез и получать большое количество нужного участка ДНК (хотя существуют и упрощенные изотермические методы, без контролируемых изменений температуры).

За один «прогон» ПЦР из цепочки ДНК получаются две, за два их становится уже четыре, и далее количество увеличивается в геометрической прогрессии. За этим экспоненциальным ростом можно следить по свечению специального красителя, который связывается с нуклеиновыми кислотами, образуя флуоресцирующий комплекс. Но если праймеры не смогли найти подходящую ДНК в образце, то реакция не пойдет и свечения не появится.

Белки и гены 


Белки и гены Геном SARS-CoV-2 представлен одноцепочечной РНК, состоящей из почти 30 тысяч звеньев-нуклеотидов. Она в миллионы раз короче человеческой ДНК и содержит совсем немного генов: три структурных белка вирусной оболочки (E, S и M), один белок нуклеокапсида (N), несколько небольших ферментов для подавления внутриклеточных механизмов защиты. Около 2/3 вирусного генома приходится на два крупных полипротеина Orf1a и Orf1b, которые кодируют РНК-репликазу (RdRP) и другие белки, необходимые для его воспроизводства в зараженной клетке.


Ключевые детали

В случае коронавирусов ПЦР дополняется еще одним важным этапом. Дело в том, что их геном представлен молекулой РНК, которую требуется предварительно превратить в ДНК с помощью фермента обратной транскриптазы (ОТ). В остальном технология неизменна и прекрасно отработана: все тесты на SARS-CoV-2, которые начали применяться в первые месяцы эпидемии, действуют именно так. Главная разница между ними состоит в структуре праймеров — и в тех участках вирусной РНК, которые были определены в качестве мишеней для них.

Полная последовательность генома SARS-CoV-2 была оперативно — еще в январе 2020 года — опубликована, что позволило специалистам выбирать подходящие цели на РНК. Например, тесты, созданные в американских Центрах по контролю и профилактике заболеваний (CDC), «ловят» РНК SARS-CoV-2 с помощью трех фрагментов генома вируса. Два из них (N1 и N2) — это участки гена N-белка, участвующего в стабилизации РНК, которые характерны именно для этого вируса; третий (N3) — участок, общий для всего семейства коронавирусов.

Дополнительные праймеры из протокола CDC связываются с определенным фрагментом человеческой ДНК, которая обязательно присутствует в пробах и служит положительным контролем. Даже если тестирование на SARS-CoV-2 не даст результата, оно покажет, что система сработала правильно и вируса в образце действительно нет. Казалось бы, технология сложна, но логична, понятна и при правильном подборе праймеров будет надежна и чувствительна. Однако на практике и протокол CDC, и другие тесты демонстрируют далеко не стопроцентную точность.


Маленькие шаги

Именно поэтому официальные данные по количеству заболевших COVID-19, обнародованные КНР 12 февраля 2020 года, так огорошили мировую общественность. Обратив внимание на подозрительное множество людей, живущих в эпицентре вспышки, но не обнаруживших болезни после тестирования, власти изменили протокол испытаний, и цифры заразившихся за сутки подскочили с примерно 800 до почти что 15 тыс. В самом деле, точность и скорость работы метода ОТ-ПЦР зависят не только от самих реакций «в пробирке», но и от каждого шага в цепочке, которая начинается с выявления подозрительного больного.

Максим Филипенко: «Молекулярная диагностика развивается весьма неплохо, даже по мировым меркам. Существует масса успешных компаний, продающих тестовые наборы за рубеж. И если регуляторы будут более открыты к сторонним производителям, то жить им станет намного легче».

Главной целью SARS-CoV-2 выступают клетки легочных альвеол, однако забор образца производят из носа или горла, где вирусных частиц на порядки меньше. В пробу их может попасть недостаточно, кроме того, она может оказаться загрязнена или банально испортиться из-за несоблюдения условий хранения, транспортировки и выделения РНК. Процесс включает множество мелких шагов, и на каждом из них возможна задержка или ошибка, тем более что тесты и протоколы разрабатывались в большой спешке. По сообщениям тех же китайских медиков, используемые ими системы дают положительные результаты не более чем у половины заболевших.

Не лучше дело обстоит и со скоростью тестирования. Сама по себе реакция ОТ-ПЦР может занимать пару часов, но весь процесс, включающий сбор и пересылку образцов в лабораторию, приспособленную для работы с высококонтагиозными инфекциями, обычно требует нескольких дней. Поэтому долгий срок тестирования заболевших в России сам по себе неудивителен. Первое время проверки проводились исключительно новосибирским научным центром «Вектор», и на одну только пересылку клинических образцов уходило значительное время. Теперь этим занято больше отечественных лабораторий, и скорость заметно выросла.

Разработка тестов на коронавирус 


Местные особенности

На начало апреля 2020 года в России официально зарегистрированы шесть тестов на SARS-CoV-2. Два из них созданы научным центром Росздравнадзора «Вектор», остальные — Центром стратегического планирования и управления рисками (ЦСП) Минздрава, ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, а также компаниями «Литех» и АО «Вектор-Бест». Еще в первые месяцы эпидемии свой тестовый набор создали и в Лаборатории фармакогеномики ИХБФМ СО РАН. Процесс этот хорошо отработан, и ученым достаточно знать точную последовательность генома, чтобы начать действовать и синтезировать экспериментальные праймеры.


Важная альтернатива

Точно диагностировать вирус можно по реакции организма — по антителам, которые иммунная система вырабатывает для борьбы с патогеном. Забрав кровь пациента, ее смешивают с антигенами — комплексами, содержащими фрагменты вирусных белков, с которыми тут же связываются антитела. Остается выявить эти комплексы с помощью флуоресценции, хроматографии или другого подходящего метода. Иммунохроматография дешевле и быстрее реакции ОТ-ПЦР и занимает несколько минут, к тому же для нее не нужно специального оборудования.

Зато разработка таких тестов сложнее: на начало апреля 2020 года такие системы лишь начали выпускать китайская компания Limingbio, американская Assay Genie, корейская SD Biosensor. О быстром прогрессе в этом направлении сообщили и несколько других биотехнологических компаний, включая российскую DRD Biotech. Антитела начинают вырабатываться лишь через одну-две недели после заражения COVID-19, поэтому иммуноанализ не поможет определить недавно заразившихся, но уже заразных людей.

Но вот проверки и испытания готовых систем требуют реальных тестов с настоящими вирусами и зараженными образцами — притом, что доступ к ним частных разработчиков в России крайне затруднен. «Наша главная проблема — в разобщенности, — резюмирует Максим Филипенко. — Молекулярная диагностика развивается весьма неплохо, даже по мировым меркам. Существует масса успешных компаний, продающих тестовые наборы за рубеж. И если регуляторы будут более открыты к сторонним производителям, то жить им станет намного легче. А значит, легче будет и врачам, и пациентам».


Роман Фишман

Статья «Проверка на вирус» опубликована в журнале «Популярная механика» (№5, Май 2020).

Похожие новости

  • 22/04/2020

    Академические организации Новосибирска проводят массовое тестирование на коронавирус

    ​В соответствии с нормативными документами Роспотребнадзора и регионального минздрава Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины ежесуточно обследуют сотни проб на наличие патогена COVID-19.
    561
  • 27/05/2020

    Академические гены «Вектора»

    ​​Сегодня по запросу «вектор» поисковик найдет прежде всего одноименный Государственный научный центр вирусологии и биотехнологий Роспотребнадзора. Об эпизодах происхождения и истории одного из мировых лидеров борьбы с коронавирусом и другими опасными инфекциями рассказывают председатель СО РАН академик Валентин Николаевич Пармон​ и выпускники НГУ разных лет: академики Валентин Викторович Власов, Ольга Ивановна Лаврик (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН) и мэр наукограда Кольцово Николай Григорьевич Красников.
    514
  • 22/11/2017

    Юбилей академика Валентина Викторовича Власова

    Валентин Викторович Власов родился 22 ноября 1947 года в г. Новосибирске. В 1969 году окончил Факультет естественных наук (химическое отделение) Новосибирского государственного университета. Далее — в НИОХ СО АН СССР: аспирантура, младший, старший научный сотрудник, заведующий лабораторией нуклеиновых кислот, заместитель директора Института.
    2848
  • 12/02/2019

    «Академический час» в Отделении ГПНТБ СО РАН

     14 февраля в 15:00 в конференц-зале Отделения ГПНТБ СО РАН в рамках программы «Академический час» состоится научно-популярная лекция «Хиггс Бозон и все, все, все...». Лектор: Лукин Петр Анатольевич, к.
    1384
  • 20/06/2018

    Возможные перспективы Академгородка 2.0

    ​Ведущие ученые СО РАН продолжили обсуждение проектов развития научной инфраструктуры Новосибирского научного центра. Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН выступил инициатором проекта «Сибирский центр малотоннажной химии».
    2050
  • 11/03/2020

    Академический час для школьников, лекция «Репарация ДНК на страже долголетия высших организмов» или «Почему «голый землекоп» живет дольше, чем мышь?»

    11 марта 2020 года в 15:00 в малом зале Дома ученых СО РАН состоится лекция академика РАН Ольги Ивановны Лаврик (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН) «Репарация ДНК на страже долголетия высших организмов» или «Почему «голый землекоп» живет дольше, чем мышь?».
    582
  • 19/04/2017

    Ученые установили, что управляет термогенезом

    ​Ранее считалось, что в термогенезе - процессе выработки тепла - ключевую роль играют макрофаги, один из видов белых клеток крови. Однако ученые из Школы медицины Икан на горе Синай (Icahn School of Medicine at Mount Sinai) в США во главе с профессором медицины Кристофом Бюттнером (Christoph Buettner) доказали, что за термогенез отвечает мозг.
    1986
  • 15/11/2019

    Александр Чернявский: сильным и энергичным людям не всегда получается найти общий язык друг с другом

    ​АЛЕКСАНДР ЧЕРНЯВСКИЙ, хирург с 35-летним стажем, в этом году начал исполнять обязанности руководителя клиники Мешалкина. В интервью «Континенту Сибирь» он рассказал о том, как клиника сумела преодолеть проблемы, с которыми столкнулась в этом году, и как планирует работать дальше.
    872
  • 15/06/2020

    Академическая платформа «Вектора». Как проверялась экспериментальная модель «треугольника Лаврентьева»

    Государственный научный центр вирусологии и биотехнологий Роспотребнадзора «Вектор» разработал первые в России тест-системы для COVID-19, а в июне начинает клинические испытания одной из вакцин от коронавируса.
    524
  • 09/10/2020

    6 лабораторий в Новосибирске исследуют технологии редактирования генома

    В этом году нобелевскую премию по химии получили ученые из Франции и США, за масштабные разработки методов редактирования генома. — В Новосибирске с этим направлением тоже хорошо. Трудно сказать, что мы входим в число мировых лидеров, но в 6 лабораториях институтов Академгородка, связанных с биологическими науками, а также на ФБУН ГНЦ Вб «Вектор» работы по этой теме активно идут, — отметил, выступая на пресс-конференции, заведующий лабораторией геномной и белковой инженерии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, директор Центра перспективных биомедицинских исследований Новосибирского государственного университета член-корреспондент РАН Дмитрий Жарков.
    385