Слова «ген» и «ДНК» слышали, наверное, все, словосочетание «прочитать геном» — почти все. Но как технически расшифровывается информация, спрятанная в ДНК? Кто владеет «генетической азбукой морзе» и что выполняет роль телеграфного ключа? Чтобы ответить на этот вопрос, журналистка «Науки в Сибири» приняла участие в первой научно-практической школе по капиллярному секвенированию ДНК, организованной Институтом молекулярной и клеточной биологии СО РАН, компаниями «Хеликон» и «Thermo Fisher Scientific».

В наше время секвенирование — то есть прочтение последовательности нуклеотидов (элементарных кирпичиков) ДНК и РНК — рутинный процесс, необходимый для работы большинства биологических лабораторий. 

 — Капиллярное секвенирование (еще его называют секвенированием по Сэнгеру) — один из самых широко используемых методов расшифровки последовательности ДНК в лабораториях. Он применяется в тех случаях, когда человеку нужно проанализировать отдельные молекулы ДНК, чаще всего в генной инженерии или в ходе медицинских исследований. Например, при создании генно-инженерных конструкций исследователю важно удостовериться, что в созданной им искусственной молекуле ДНК все работает именно так, как он предполагает. В медицине метод применяется при поиске каких-то конкретных мутаций у пациентов, чтобы убедиться: диагноз поставлен правильно. Соответственно, берут образец ткани или физиологической жидкости этого пациента, выделяют ДНК и прочитывают интересующие их места в геноме, — объяснил заместитель директора Института молекулярной и клеточной биологии СО РАН, заведующий лабораторией геномики ИМКБ СО РАН кандидат биологических наук Степан Белякин.

На школу приехало 15 человек из Институтов СО РАН, НГУ, научных организаций Кемерово, Красноярска, Томска.

 

Участники школы

 

— Мы организовали это мероприятие, в основном, чтобы поделиться нашими опытом, показать, какие проблемы возникают при капиллярном секвенировании и как их решать. Я предполагал, что придут преимущественно люди из соседних институтов, возможно потенциальные заказчики Центра коллективного пользования ИМКБ СО РАН.  Однако благодаря активности компании «Хеликон», выступившей соорганизатором школы, приехали люди еще  из других городов. Поскольку у нас большой опыт использования метода секвенирования по Сэнгеру, мы, наверное, можем утверждать, что с основными проблемами уже успели столкнуться и как-то их или решить, или развести руками. Этому и были посвящены лекции сотрудников нашего института, а два доклада представителей компании Thermo Fisher Scientific: затрагивали стандартные вещи — устройство секвенатора, его настройку и использование, пробоподготовку, — добавил Степан Белякин.

 При секвенировании по Сэнгеру фрагмент ДНК, который нужно прочитать, сначала внедряется в плазмиду (кольцевая ДНК у бактерий), затем бактерии, размножаясь, «штампуют» множество копий исходного фрагмента, после чего многократно скопированные участки ДНК выделяют из микроорганизмов и  добавляют в смесь для секвенирующей реакции. А уже в этой смеси начинается самое интересное — исходный фрагмент снова много раз тиражируется, но уже не полностью, а  «обрывками», длина которых может различаться, как минимум, на один нуклеотид. Множить фрагмент помогает ДНК-полимераза, синтез начинается с «затравки» — праймера, а «обрывает»  кусочки ДНК терминатор — нуклеотид, обладающий свойством прекращать синтез цепи ДНК. Каждый терминатор несет на себе флуоресцентную метку, которая позволяет однозначно определить его «имя»  —  A (аденин), T (тимин), G (гуанин) или C (цитозин).

Чтобы наконец-то прочитать нуклеотидную последовательность исходного фрагмента, «обрывки» ДНК дифференцируются по длине с помощью электрофореза — перемещения частиц в геле под действием электрического поля.  Когда на отрицательно заряженную молекулу ДНК действует электрическое поле, она  двигается по капилляру секвенатора, заполненному гелем, к положительному полюсу. 

 

Капилляры секвенатора

 

Капилляры представляют собой тонкие трубочки, диаметр которых меньше сечения человеческого волоса, они состоят из сверхчистого кремния и окружены  металлической оболочкой. Известно, что в плотном геле короткие «кусочки» ДНК «проходят»  быстрее, чем длинные. Соответственно, их можно ранжировать по длине, а разрешающая способность равна одному нуклеотиду.

Когда «кусочки» ДНК «добегают» до положительного полюса капилляра, на  фотографической матрице секвенатора определяется цвет нуклеотида-терминатора по его флуоресцентной метке. Таким образом, можно определить последовательность нуклеотидов исходного фрагмента — например, если короткий кусочек ДНК из двух нуклеотидов маркирован буквой Т, то значит на втором месте последовательности ДНК тоже стоит нуклеотид тимин и так далее.

Участникам школы предстояло самим приготовить реакционную смесь (фрагмент ДНК для прочтения последовательности был предоставлен уже готовый), провести секвенирующую реакцию в амплификаторе — приборе, который многократно (на протяжении 35 циклов) нагревает и охлаждает смесь в течение двух часов для того, чтобы в ней произошло образование «обрывочков» ДНК, а затем очистить продукты реакции и загрузить их в секвенатор.

На взгляд неопытного человека, самое сложное в приготовлении реакционной смеси — правильно пользоваться автоматической пипеткой. Поскольку компоненты измерялись в микролитрах, (1 мкл — 1/1000 миллилитра), очень сложно было заметить, набран ли необходимый реагент, на глаз это определить практически невозможно.

 

Работа с пипеткой

 

Затем, после двухчасового циклического нагревания смеси в амплификаторе, проводилась очистка продуктов реакции от неотработавших праймеров. После чего участники познакомились с восьмиканальным (восьмикаппилярным) секвенатором, производительность которого — до 1000 пар нуклеотидов за один цикл работы прибора, а загрузить единовременно можно восемь образцов. На аналогичных машинах был впервые, в течение 13 лет, прочитан геном человека. Сейчас, конечно, расшифровка таких больших объемов информации производится методом полногеномного секвенирования, а не капиллярного. 

 

Секвенатор изнутри

 

Надо отметить, первые секвенаторы были не только громоздки и медлительны, но и даже опасны для здоровья — терминаторы помечались не флуоресцентной, а радиоактивной меткой. Современный же прибор занимает не больше места, чем средних размеров копировальный аппарат. Более того, всю работу по определению последовательности нуклеотидов, секвенатор выполняет сам и в качестве результата выгружает последовательность ДНК и таблицу с графиками, похожими на кардиограммы — на ней визуализированы цветом разные нуклеотиды, а каждая буква («имя» нуклеотида) выглядит на графике, как пик. После получения результата участникам школы предстояло оценить качество последовательности по интенсивности пиков и другим параметрам. 

 

Графики

 

К сожалению, отсутствие навыков работы с автоматической пипеткой не прошло даром — корреспонденту «Науки в Сибири» «прочитать» ДНК не удалось. Зато у всех остальных участников получилось отлично. Завершилась школа обзором бесплатного программного обеспечения для анализа данных и современных решений для секвенирования.

 

Надежда Дмитриева

Фото автора

Источники

Капиллярное секвенирование, как оно есть
Наука в Сибири (sbras.info), 11/04/2018

Похожие новости

  • 09/11/2017

    Опубликованы итоги конкурса проектов комплексных междисциплинарных фундаментальных научных исследований (Комфи) 2017 года

    На сайте Российского фонда фундаментальных исследований опубликованы итоги конкурса проектов комплексных междисциплинарных фундаментальных научных исследований «Молекулярные основы функционирования живых систем» (Комфи) 2017 года.
    763
  • 03/04/2017

    Ученые из НГУ совместно с коллегами из университета Эдинбурга получили грант Британского Совета

    ​Новосибирский государственный университет и университет Эдинбурга (UoE) получили совместный грант Британского Совета в рамках программы межинститутского сотрудничества России и Великобритании. Поддержанный проект направлен на расшифровку молекулярных основ сердечно-сосудистых заболеваний, одной из ведущих причин смертности как в России, так и Великобритании.
    982
  • 13/02/2018

    Биологи НГУ победили на Студенческом биологическом турнире

    ​В МГУ имени М.В. Ломоносова завершился III Студенческий биологический турнир. Честь НГУ отстаивали две команды, и обе показали достойный результат. Команда «Секрет Дегенерации» заняла первое место, команда «Умственно усталые» – второе.
    670
  • 17/03/2017

    Сибирские физики создадут точнейшие атомные часы

    Ученые из Института лазерной физики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирского государственного университета и из Новосибирского государственного технического университета разработали сверхстабильный лазер для атомных часов, который позволит российским физикам создать устройства для измерения времени, не уступающие в точности западным аналогам, говорится в статье, опубликованной в Journal of Physics: Conf.
    1500
  • 19/04/2018

    Новосибирские генетики вошли в число победителей конкурса РНФ для научных групп

    ​​Поддержку Фонда получат исследования, направленные на поиск генов устойчивости растений к болезням и механизмов развития заболеваний человека, вызванных заражением паразитами. Ежегодно в России проходят конкурсы научно-исследовательских проектов, победители которых получают поддержку Российского научного фонда.
    464
  • 30/08/2016

    С помощью гранта Минобрнауки НГУ усовершенствует онлайн-курсы

    ​Новосибирский госуниверситет выиграл грант Министерства образования и науки РФ по направлению «Стартап в образовании». Проект посвящен разработке и внедрению интерактивных и игровых технологий в дистанционном обучении.
    1153
  • 28/04/2017

    Биолог из Новосибирска вошел в экспертный совет РНФ

    ​Биолог Дмитрий Жарков, заведующий лабораторией белковой инженерии НГУ, вошел в экспертный совет Российского научного фонда. Российский научный фонд осуществляет финансовую и организационную поддержку фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований посредством финансирования прошедших конкурсный отбор научных, научно-технических программ и проектов.
    1149
  • 19/11/2015

    ИЯФ СО РАН завершил набор в стипендиальную программу 2015 года

    ​Завершился очередной набор в стипендиальную программу Института ядерной физики им. Г.И.Будкера СО РАН. В этом году конкурс прошли 23 школьника из Специализированного учебно-научного центра НГУ (СУНЦ НГУ, ФМШ) и 4 студента Новосибирского государственного университета (НГУ).
    2074
  • 11/09/2018

    XVI Интеллектуальная игра по ботанике на приз ЦСБС СО РАН

    ​17 сентября 2018 будет проходить XVI Интеллектуальная игра по ботанике на приз ЦСБС СО РАН  в конференц-зале Центрального сибирского ботанического сада СО РАН, по адресу: Золотодолинская, 101.
    201
  • 22/10/2018

    Подведены итоги Сибирского студенческого биологического турнира

    ​Подведены итоги Сибирского студенческого биологического турнира – 2018. Победу одержали учащиеся Новосибирского государственного университета. Как рассказали организаторы Турнира, всего в 2018 году за победу боролись четыре команды: из Красноярска, Екатеринбурга и две из Новосибирска: «Игроки показали высокий уровень игры в эти насыщенные три дня, а на церемонии закрытия Турнира в Точке Кипения были подведены итоги четырех боев».
    48