Слова «ген» и «ДНК» слышали, наверное, все, словосочетание «прочитать геном» — почти все. Но как технически расшифровывается информация, спрятанная в ДНК? Кто владеет «генетической азбукой морзе» и что выполняет роль телеграфного ключа? Чтобы ответить на этот вопрос, журналистка «Науки в Сибири» приняла участие в первой научно-практической школе по капиллярному секвенированию ДНК, организованной Институтом молекулярной и клеточной биологии СО РАН, компаниями «Хеликон» и «Thermo Fisher Scientific».

В наше время секвенирование — то есть прочтение последовательности нуклеотидов (элементарных кирпичиков) ДНК и РНК — рутинный процесс, необходимый для работы большинства биологических лабораторий. 

 — Капиллярное секвенирование (еще его называют секвенированием по Сэнгеру) — один из самых широко используемых методов расшифровки последовательности ДНК в лабораториях. Он применяется в тех случаях, когда человеку нужно проанализировать отдельные молекулы ДНК, чаще всего в генной инженерии или в ходе медицинских исследований. Например, при создании генно-инженерных конструкций исследователю важно удостовериться, что в созданной им искусственной молекуле ДНК все работает именно так, как он предполагает. В медицине метод применяется при поиске каких-то конкретных мутаций у пациентов, чтобы убедиться: диагноз поставлен правильно. Соответственно, берут образец ткани или физиологической жидкости этого пациента, выделяют ДНК и прочитывают интересующие их места в геноме, — объяснил заместитель директора Института молекулярной и клеточной биологии СО РАН, заведующий лабораторией геномики ИМКБ СО РАН кандидат биологических наук Степан Белякин.

На школу приехало 15 человек из Институтов СО РАН, НГУ, научных организаций Кемерово, Красноярска, Томска.

 

Участники школы

 

— Мы организовали это мероприятие, в основном, чтобы поделиться нашими опытом, показать, какие проблемы возникают при капиллярном секвенировании и как их решать. Я предполагал, что придут преимущественно люди из соседних институтов, возможно потенциальные заказчики Центра коллективного пользования ИМКБ СО РАН.  Однако благодаря активности компании «Хеликон», выступившей соорганизатором школы, приехали люди еще  из других городов. Поскольку у нас большой опыт использования метода секвенирования по Сэнгеру, мы, наверное, можем утверждать, что с основными проблемами уже успели столкнуться и как-то их или решить, или развести руками. Этому и были посвящены лекции сотрудников нашего института, а два доклада представителей компании Thermo Fisher Scientific: затрагивали стандартные вещи — устройство секвенатора, его настройку и использование, пробоподготовку, — добавил Степан Белякин.

 При секвенировании по Сэнгеру фрагмент ДНК, который нужно прочитать, сначала внедряется в плазмиду (кольцевая ДНК у бактерий), затем бактерии, размножаясь, «штампуют» множество копий исходного фрагмента, после чего многократно скопированные участки ДНК выделяют из микроорганизмов и  добавляют в смесь для секвенирующей реакции. А уже в этой смеси начинается самое интересное — исходный фрагмент снова много раз тиражируется, но уже не полностью, а  «обрывками», длина которых может различаться, как минимум, на один нуклеотид. Множить фрагмент помогает ДНК-полимераза, синтез начинается с «затравки» — праймера, а «обрывает»  кусочки ДНК терминатор — нуклеотид, обладающий свойством прекращать синтез цепи ДНК. Каждый терминатор несет на себе флуоресцентную метку, которая позволяет однозначно определить его «имя»  —  A (аденин), T (тимин), G (гуанин) или C (цитозин).

Чтобы наконец-то прочитать нуклеотидную последовательность исходного фрагмента, «обрывки» ДНК дифференцируются по длине с помощью электрофореза — перемещения частиц в геле под действием электрического поля.  Когда на отрицательно заряженную молекулу ДНК действует электрическое поле, она  двигается по капилляру секвенатора, заполненному гелем, к положительному полюсу. 

 

Капилляры секвенатора

 

Капилляры представляют собой тонкие трубочки, диаметр которых меньше сечения человеческого волоса, они состоят из сверхчистого кремния и окружены  металлической оболочкой. Известно, что в плотном геле короткие «кусочки» ДНК «проходят»  быстрее, чем длинные. Соответственно, их можно ранжировать по длине, а разрешающая способность равна одному нуклеотиду.

Когда «кусочки» ДНК «добегают» до положительного полюса капилляра, на  фотографической матрице секвенатора определяется цвет нуклеотида-терминатора по его флуоресцентной метке. Таким образом, можно определить последовательность нуклеотидов исходного фрагмента — например, если короткий кусочек ДНК из двух нуклеотидов маркирован буквой Т, то значит на втором месте последовательности ДНК тоже стоит нуклеотид тимин и так далее.

Участникам школы предстояло самим приготовить реакционную смесь (фрагмент ДНК для прочтения последовательности был предоставлен уже готовый), провести секвенирующую реакцию в амплификаторе — приборе, который многократно (на протяжении 35 циклов) нагревает и охлаждает смесь в течение двух часов для того, чтобы в ней произошло образование «обрывочков» ДНК, а затем очистить продукты реакции и загрузить их в секвенатор.

На взгляд неопытного человека, самое сложное в приготовлении реакционной смеси — правильно пользоваться автоматической пипеткой. Поскольку компоненты измерялись в микролитрах, (1 мкл — 1/1000 миллилитра), очень сложно было заметить, набран ли необходимый реагент, на глаз это определить практически невозможно.

 

Работа с пипеткой

 

Затем, после двухчасового циклического нагревания смеси в амплификаторе, проводилась очистка продуктов реакции от неотработавших праймеров. После чего участники познакомились с восьмиканальным (восьмикаппилярным) секвенатором, производительность которого — до 1000 пар нуклеотидов за один цикл работы прибора, а загрузить единовременно можно восемь образцов. На аналогичных машинах был впервые, в течение 13 лет, прочитан геном человека. Сейчас, конечно, расшифровка таких больших объемов информации производится методом полногеномного секвенирования, а не капиллярного. 

 

Секвенатор изнутри

 

Надо отметить, первые секвенаторы были не только громоздки и медлительны, но и даже опасны для здоровья — терминаторы помечались не флуоресцентной, а радиоактивной меткой. Современный же прибор занимает не больше места, чем средних размеров копировальный аппарат. Более того, всю работу по определению последовательности нуклеотидов, секвенатор выполняет сам и в качестве результата выгружает последовательность ДНК и таблицу с графиками, похожими на кардиограммы — на ней визуализированы цветом разные нуклеотиды, а каждая буква («имя» нуклеотида) выглядит на графике, как пик. После получения результата участникам школы предстояло оценить качество последовательности по интенсивности пиков и другим параметрам. 

 

Графики

 

К сожалению, отсутствие навыков работы с автоматической пипеткой не прошло даром — корреспонденту «Науки в Сибири» «прочитать» ДНК не удалось. Зато у всех остальных участников получилось отлично. Завершилась школа обзором бесплатного программного обеспечения для анализа данных и современных решений для секвенирования.

 

Надежда Дмитриева

Фото автора

Источники

Капиллярное секвенирование, как оно есть
Наука в Сибири (sbras.info), 11/04/2018

Похожие новости

  • 23/08/2018

    В Новосибирске проходит Международная научная конференция «Хромосома-2018»

     Значимую встречу ученых организует Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН совместно с Новосибирским государственным университетом. Большое внимание в этом году участники уделяют, в частности, проблеме редактирования генома.
    482
  • 11/10/2017

    Научная школа по молекулярной и клеточной биологии прошла в Новосибирске

    ​Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН провел третью Научную школу — первая состоялась в 2010 году. Для участия зарегистрировались 107 слушателей и докладчиков из 14 организаций Новосибирска, Томска, а также Казахстана.
    780
  • 26/08/2015

    В Новосибирске проходит Международная научная конференция "Хромосома-2015"

    Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН совместно с Новосибирским государственным университетом проводят Международную научную конференцию "Хромосома-2015", посвященную в этом году 100-летнему юбилею Хромосомной теории наследственности.
    1169
  • 07/07/2017

    В НГУ обсудили неинвазивные методы биопсии при онкологии

    ​В Новосибирске прошла конференция с практической школой «Перспективы жидкостной биопсии в практической онкологии» — НГУ стал одной из площадок для проведения мероприятия вместе с Институтом химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и Институтом молекулярной и клеточной биологии СО РАН.
    1294
  • 04/08/2017

    Научная школа по молекулярной и клеточной биологии 2017 года

    5-6 октября 2017 года в ИМКБ СО РАН пройдет III Научная школа по молекулярной и клеточной биологии. Она станет продолжением серии научно-образовательных мероприятий, проводимых в ИМКБ с 2010 года.
    1446
  • 25/10/2018

    Молодые ученые обсудили в рамках OpenBio-2018 актуальные вопросы молекулярной биологии

    ​На молодежной конференции, прошедшей в рамках форума OpenBio-2018 в наукограде Кольцово, молодые специалисты в сфере микробиологии представили результаты своих научных исследований, которые могут пригодиться в борьбе с ожирением и хроническим стрессом, а также с такими трудно поддающимися лечению недугами, как, например, рак молочной железы и простаты.
    181
  • 04/09/2016

    IV Молодёжная школа «Магнитный резонанс и магнитные явления в химической и биологической физике»

    ​С 4 по 8 сентября 2016 г. в новосибирском Академгородке пройдет IV Молодежная школа с международным участием "Магнитный резонанс и магнитные явления в химической и биологической физике".
    2341
  • 26/08/2016

    Ученые СО РАН отвечают на вопросы о безопасности питания

    ​Какие вопросы безопасности питания на сегодняшний день наиболее актуальны? Как повлияет на развитие пищевой отрасли в России законопроект о запрете ГМО? В преддверии Международного симпозиума "Генетика и геномика растений для продовольственной безопасности" корреспонденты "НВС" поговорили об этом с руководителем Исследовательского центра продовольственной безопасности ЭФ НГУ, старшим научным сотрудником Института экономики и организации промышленного производства СО РАН, кандидатом экономических наук Юлией Сергеевной Отмаховой и главным научным сотрудником Центра, заведующей сектором Федерального исследовательского центра Институт цитологии и генетики СО РАН доктором биологических наук Еленой Константиновной Хлесткиной.
    2633
  • 18/06/2018

    Международная конференция «Хромосома 2018»

    С 20 по 24 августа 2018 года Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН совместно с Новосибирским государственным университетом проводит четвертую международную научную конференцию "Хромосома 2018".
    647
  • 11/09/2018

    В Новосибирске биологи обсудят метод, изменяющий реальность

    ​В технопарке новосибирского Академгородка открылся международный конгресс «CRISPR—2018», посвященный этому методу геномного редактирования. На конгресс съехалось около 360 ученых из США, Франции, Германии, Северной Кореи, Турции, Казахстана, Беларуси и 16 городов России, включая Москву и Санкт-Петербург.
    339